vanquish液相色谱仪。是仪器信息网微信公众号联合仪器导购专场共同创立的一档仪器科普栏目，每周推荐一类仪器。。（文末有常见品牌）

液相色谱（Liquid chromatography 简称LC）是利用混合物在液-固或不互溶的两种液体之间分配比的差异，对混合物进行先分离，而后分析鉴定的仪器。

今天小谱就其发展史、检测原理、结构等和大家进行探讨，一文把液相色谱仪讲通透。

（如果读完文章您觉得还有哪些想听的知识点小谱没有讲到，亦或是觉得小谱文章中有哪些观点您不太认同，欢迎您积极留言。)

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“液相色谱仪”的诞生和发展

早在古罗马时期，人们就已经知道将一滴包含混合色素的溶液滴在一块布或一片纸上，通过观察溶液展开的同心圆环来分析染料和色素。这就是最古老的液相色谱分离技术。

二十世纪初期，俄国植物学家茨维特（Tsweet）在1906年发表的关于色谱的论文中写到：将一植物色素的石油醚溶液从一根主要装有碳酸钙吸附剂的玻璃管上端加入，沿管滤下，然后用纯石油醚淋洗，结果按照不同色素的吸附顺序在管内观察到它们相应的色带，他把这些色带称之为“色谱图”（Chromatogram）。遗憾的是，在随后的二十年内这一新的分析技术都没有得到科学界的注意和重视。

直到1931年，库恩（Kohn）报道了他们关于胡萝卜素的分离方法时，色谱法才引起了科学界的广泛注意。

1941年，马丁（Matin）和辛格（Synge）用一根装满硅胶微粒的色谱柱，成功地完成了乙酰化氨基酸混合物的分离，建立了液液分配色谱方法，他们也因此获得了1952年诺贝尔化学奖。1944年，康斯坦因（Consden）和马丁（Matin）建立了纸色谱法。1949年，马丁建立了色谱保留值与热力学常数之间的基本关系式，奠定了物化色谱的基础。1952年，马丁和辛格创立了气液色谱法，成功地分离了脂肪酸和脂肪胺系列，并对此法的理论与实验做了精辟的论述，建立了塔板理论。1956年，斯达（Stall）建立了薄层色谱法。同年，范·底姆特（Van Deemter）提出了色谱理论方程；后来吉丁斯（Giddings）对此方程作了进一步改进，并提出了折合参数的概念。这一系列色谱技术和理论的发展都为HPLC 的问世打下了扎实的基础。

1960年代早期，由于气相色谱对高沸点有机物分析的局限性，为了分离蛋白质、核酸等不易气化的大分子物质，分析化学家们把目光转向了液相色谱。液相色谱也的确从蛋白质中分离出了纯的化合物，但使用液相色谱又出现了一个新的问题：分离时间相当长。当时所使用的色谱柱效率非常低，具有代表性的柱子是一米来长或更长，为了获得必要的分辨率，有时还得使用多根柱，液体流动的产生靠重力，其流动速度是每小时几毫升或更少，无计算机自动操作仪器和进行数据收集。当时的生物学工作者往往要经过好几年的努力才能从一个组织中把蛋白质完全分离出来。

在仪器发展方面，HPLC 的第一个雏形是由斯坦因（Stein）和莫尔（Moore）于1958年发展起来的氨基酸分析仪（AAA），这种仪器能够进行自动分离和蛋白质水解产物的分析。在六十年代早期的相关进展是莫尔（Moore）发展起来的凝胶渗透色谱（GPC）。不久以后，沃特世（Waters）有限公司制造了商业GPC仪，这种仪器经过微小的改进之后可用于HPLC分离。

1968～1971年间，第一台普遍适用的HPLC商用系统被推出。这种新的色谱仪是由科克兰（Kirkland）、哈伯、荷瓦斯（Horvath）、莆黑斯（Preiss）和里普斯克（Lipsky）等人研制发明的。从此，开启了高效液相色谱的时代，也成之为现代液相色谱。

Richard Henry (circa 1969) at DuPont Instrument Products Division in front of a Medel 820 HPLC system

高效液相色谱使用粒径更细的固定相填充色谱柱，提高色谱柱的塔板数，以高压驱动流动相，使得经典液相色谱需要数日乃至数月完成的分离工作得以在几个小时甚至几十分钟内完成。

Development of HPLC particles instrument pressure requirements increase dramatically as particle size decrease.

02

“液相色谱仪”的结构及原理

液相色谱仪的结构

高效液相色谱仪主要由储液器、高压泵、进样器、色谱柱、检测器、记录仪六部分组成。

1、储液器

储液器是用于存放溶剂的装置。贮液器中的溶剂必须很纯，贮液器材料要耐腐蚀，对溶剂呈惰性，一般情况下通常采用1升~2升的大容量玻璃瓶，也可采用不锈钢制成的容器，贮液器应配有溶剂过滤器，以防止流动相中的颗粒进入泵内，溶剂过滤器一般用耐腐蚀的镍合金制成，孔隙大小一般为2μm。

2、高压泵

高压泵应耐压、耐腐蚀、密封性好。其主要用于输送流动相，其压力一般为几兆帕至数十兆帕，这时液体的黏度比气体大 100 倍。同时由于固定相的颗粒极细，柱内压降大，为保证一定的流速，必须借助高压迫使流动相通过柱子。高压泵应无脉动或脉动极小，以保证输出的流动相具有恒定的流速，同时采用脉动阻尼装置可将产生的脉动除去，使流动相的流量变动范围不宜超过 2%~3%。高压泵主要分为恒压泵、恒流泵和螺旋传动注射泵三类。

（1）恒压泵

恒压泵输出的压力恒定，当具有一定压力的气体作用在一个大面积活塞上,大面积活塞再驱动一个小面积活塞，小面积活塞承受的压力是大面积活塞的几十倍，从而得到压力恒定的流出液。

（2）恒流泵

恒流泵的主要功能是输出的流量恒定，如往复柱塞泵、螺旋传动注射泵等。往复柱塞泵与恒压泵不同，通常采用电驱动活塞，当活塞迅速向上动时，由于减压使入口止逆阀开启，出口止逆阀关闭，贮液器中的流动相被吸入柱内，形成一个循环，然后再开始下一个循环。使用这种泵时一定要连接脉动阻尼器，将产生的脉动除去，若采用双活塞泵，使双活塞在相移180°下工作，可使脉动互相抵消，减小噪声。往复柱塞泵的流量与外界阻力无关，恒流泵具有体积小的特点，非常适合于梯度洗脱。

（3）螺旋传动注射泵

螺旋传动注射泵是用电力以很慢的恒定速率驱动活塞，使流动相连续输出，当活塞到达末端时，输出中止，然后由另一个吸入冲程使溶剂重新充满再开始第二次输出，输出时间的长短决定于泵腔体积及输出流量。

3、进样器

液相色谱仪进样器普遍使用高压进样阀，用微量注射器将样品注入样品环管，使用的样品环管分别有不同的尺寸，可根据分析要求选用。当进样阀手柄放在吸液位置时，流动相直接通过孔的通路流向色谱柱，样品通过注射器从另外的位置进入样品环管，如果有过量的样品则会从出口孔排出，然后将手柄转到进样位置，此时流动相便将样品带进色谱柱。

4、色谱柱

色谱柱是整个色谱系统的心脏，它的质量优劣直接影响到分离的效果。一般情况下色谱柱通常采用不锈钢管制成，并且柱内壁必须光洁平滑，否则内壁的纵向沟痕和表面多孔性也会引起谱带的展宽。柱接头的体积应尽可能小，柱长一般为10cm~25cm，内径4mm ~5mm。若使用直径为5μm~10μm固定相颗粒，理论塔板可达到 5×104/m。尺寸排阻色谱柱的内径通常大于5mm，制备色谱柱则会更大；为了减少溶剂用量，可采用微径柱，内径为1mm，长度为30mm~75mm，若采用3μm颗粒，理论塔板数高达1×105/m。

为了保护分析柱不被污染，有时需在分析柱前加一短柱，约数厘米长，此柱称为保护柱。为了防止保护柱过分增加柱阻力，在保护柱中使用的颗粒大小约为10μm~30μm。

5、检测器

液相色谱仪常用的检测器有紫外吸收检测器、光电二极管阵列检测器、示差折光检测器、荧光检测器、蒸发光散射检测器等。

液相色谱仪的工作原理

储液器中的流动相通过高压泵注入系统，试样溶液经进样器进入流动相，被流动相载入色谱柱内，试样溶液中的各组分在两相中具有不同的分配系数，因此，当两相相对运动，经过反复多次的吸附-解吸分配过程，各组分在移动速度上产生较大的差别，被分离成单个组分依次从柱内流出，通过检测器时，样品浓度被转换成电信号传送到记录仪，数据以图谱形式打印出来。

高效液相色谱基本构造图（图源网络）

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“液相色谱仪”的分类

液相色谱根据分离机理的不同可分为：液-固吸附色谱、液-液分配色谱、离子交换色谱、离子对色谱法、分子排阻色谱(或凝胶渗透色谱)等。

1、液-固吸附色谱

流动相为液体，固定相为固体吸附剂，是通过组分在两相间的多次吸附与解吸平衡实现分离的。适合分离的物质为中等相对分子质量的油溶性试样，凡是能够用薄层色谱分离的物质均可用此法分离。

2、液-液分配色谱

流动相和固定相都是液体的色谱法即为液液分配色谱。该方法是利用样品组分在两种不相溶的液相间的分配来进行分离。一种液相为流动相，另一种是涂于载体上的固定相。可以分离各种无机、有机化合物

流动相极性小于固定相极性的液-液色谱法称为正相分配色谱法。

流动相极性大于固定相极性的液-液色谱法称为反相分配色谱法。

3、离子交换色谱

以离子交换树脂或化学键合离子交换剂为固定相，利用被分离组分离子交换能力的差别或选择性系数的差别而实现分离。

按照可交换离子所带电荷符号的不同又可分为阳离子交换色谱法和阴离子交换色谱法。

离子交换色谱主要是用来分离离子或可离解的化合物。它不仅广泛地应用于无机离子的分离，而且广泛地应用于有机和生物物质，如氨基酸、核酸、蛋白质等的分离，在生物化学领域得到了广泛的应用。

4、离子对色谱法

将一种或多种与目标化合物离子电荷相反的离子（称为离子对）加入到流动相或者固定相中，使其与目标化合物离子结合形成离子对化合物，从而影响目标化合物的保留行为。离子对色谱和反相色谱有很多共同的地方。使用的固定相和流动相大致相似，不同的是，在离子对色谱的流动相中加入了离子对试剂。

离子对试剂通常分为以下两类：

用于酸性化合物：三乙胺，四丁基氢氧化铵，四丁基溴化铵，十二烷基三甲基氯化铵等。

用于碱性物质：三氟乙酸，戊烷磺酸钠，己烷磺酸钠，庚烷磺酸钠，辛烷磺酸钠，十二烷基磺酸钠，十二烷基硫酸钠等。

具体离子对试剂的选择没有什么特殊的要求，根据目标化合物的酸碱性进行选择就好。如果目标化合物是弱酸性或弱碱性的，离子对试剂对应选择强碱性或强酸性为最佳。

离子对色谱法特别适合一些生化试样如核酸、核苷、生物碱以及药物等分离。

5、分子排阻色谱法

分子排阻色谱法又称空间排阻色谱法（SEC）、凝胶色谱法，是利用多孔凝胶固定相的独特性产生的一种，主要根据凝胶孔隙的孔径大小与高分子样品分子的线团尺寸间的相对关系而对溶质进行分离分析的方法。

适用于对未知样品的探索分离，它能很快提供样品按分子大小组成的全面情况，并迅速判断样品是简单的还是复杂的混合合物，并提供样品中各组分的近似分子量。这种分离方法不宜用于分子大小组成相似或分子大小仅差10%的组分分析，如同分异构体的分离不宜用分子排阻色谱法。

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常用的几种“液相色谱检测器”

液相色谱检测器常用的一般以下几种：

1、紫外可见检测器

紫外可见光检测器是应用最广泛的检测器，遵循的原理是郎伯比尔定律。

紫外可见检测器灵敏度高，线性范围宽，对流速和温度变化不敏感，可用于梯度洗脱分离。该检测器要求被检测样品组分有紫外-可见光吸收，而使用的流动相无吸收，或在被测组分吸收波长处无吸收。一般选择在待分析物最大吸收波长处进行检测，以获得最高灵敏度和抗干扰能力。在没有最大吸收时，可采用末端吸收。检测波长的选择除取决于待测物质的成分和分子结构外，还必须考虑流动相组成、共存组分干扰等因素。特别是各种溶剂都有一定的透过波长下限值，超过这个波长，溶剂的吸收会变得很强，以至于不能很好地测出待测物质的吸收强度。

2、光电二极管阵列检测器（Photodiode Array Detector）

简称PDA，又称为二极管阵列检测器（DAD）。这种检测器以光电二极管阵列作为检测元件，可进行多通道并行检测，在一次色谱测量中，可同时获得时间、波长、吸光度三者的关系，通过计算机处理，在荧光屏上显示出三维图谱，也可作出任意波长的吸光度-时间曲线和任意时间的吸光度-波长曲线。

3、示差折光检测器

示差折光检测器是一种通用型检测器。基于连续测定色谱柱流出物光折射率的变化而用于测定溶质浓度，溶液的光折射率是溶剂流动相和溶质各自的折射率乘以其物质的量浓度之和，溶有样品的流动相和流动相本身之间光折射率之差即表示样品在流动相中浓度。

原则上，凡是与流动相光折射率有差别的样品都可用它来测定，其检测限可达(10^-6～10^-7)g/ml。应注意的是，选择溶剂时必须考虑溶剂的光折射率。但这种检测器灵敏度低，对温度、流动相组成等的变化敏感，而且与梯度洗脱不相容，很大程度地限制了它的应用范围。在药物分析中，这种检测器多用于多糖类、萜类化合物等分子量和含量的测定。

4、荧光检测器（Fluorescence Detector）

荧光检测器是基于化合物的光致发光现象，荧光检测器流通池为直角形的试样池，用石英材料制成。这一检测器特别适用于痕量组分和能显示荧光的物质检测。这种检测器具有极高的灵敏度和良好的选择性。一般来说，它比紫外吸收检测器的灵敏度要高10-1000倍，可达μg/L级，而且需要的试样很少，因此在药物和生化分析中有着广泛的应用。

5、蒸发光散射检测器（ELSD）

蒸发光散射检测器是一种新型的通用型质量检测器，不同于紫外和荧光检测器，ELSD的响应不依赖于样品的光学特性，任何挥发性低于流动相的样品均能被检测，不受其官能团的影响。ELSD检测过程主要分为三个步骤：首先是雾化过程，用惰性气体或净化空气将色谱柱流出物雾化；第二步是蒸发过程，流动相在加热管（漂移管）中蒸发；第三步是检测，测定留下来的样品颗粒的光散射。

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“高效液相色谱仪“的应用

1、在生命科学领域的应用

氨基酸、多肽、蛋白质、核碱、核苷、核苷酸、核酸（RNA、DNA）等重要的生命物质，可以采用液相色谱仪纯化、分析测定。

2、药物分析

合成药物的纯化及质量控制，中草药有效成分的分离制备及纯度测定，以及临床医学的药代动力学研究中的分离分析都采用液相色谱法。据报道，除聚合物外，约80%的药物都能用液相色谱仪进行分离和纯化。特别是手性药物的分离分析，液相色谱仪已经是一种重要的分析方法。

3、食品分析

主要可分为：食品成分，特别是营养物质，如糖、有机酸、维生素、蛋白质、氨基酸、脂肪等分析；食品添加剂，如防腐剂、抗氧化剂、合成色素、甜味剂和保鲜化学物质的分析；食品中有机污染物，如农兽药残留和真菌霉素等的分析。

4、环境监测

高效液相色谱仪已在环境监测中得到广泛应用，特别适用于分子量大、挥发性低、热稳定性差的有机污染物的分离和分析。如多环芳烃、酚类、多环联苯、邻苯二甲酸酯类、联苯胺类、阴离子表面活性剂、农业生产体系农药、除草剂等。

5、精细化工

对于一些具有较高分子量和较高沸点的有机化合物，如高碳数脂肪族或芳香族的醇、醛和酮、醚、酸、酯等化工原料，以及各种表面活性剂、药物、农药、染料等化工产品，均可液相色谱仪分析。

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“液相色谱仪”常见故障及解决

高效液相作为一种高精密仪器，如果在使用过程中不按照正确操作的话，就容易导致一些问题。其中比较常见的就是柱压问题、漂移问题、峰型异常问题。

1、柱压问题

柱压问题是使用高效液相色谱仪过程中需要密切注意的地方，柱压的稳定与色谱图峰形的好坏、柱效、分离效果及保留时间等密切相关。所谓柱压稳定并不是指压力值稳定于一个恒定值而是指压力波动范围在50 PSI（3.3 Bar）之间（在使用梯度洗脱时，柱压平稳缓慢的变化是允许的）。压力过高、过低都属于柱压问题。

（1）压力过高

这是高效液相色谱仪在使用中最常见的问题，指的是压力突然升高，一般都是由于流路中有堵塞的原因。此时，我们应该分段进行检查。

a. 首先断开真空泵的入口处，此时PEEK管里充满液体，使PEEK管低于溶剂瓶，看液体是否自由滴下，如果液体不滴或缓慢滴下，则是溶剂过滤头堵塞。

处理方法：用30%的硝酸浸泡半个小时，在用超纯水冲洗干净。如果液体自由滴下，溶剂过滤头正常，再检查；

b. 打开Purge阀，使流动相不经过柱子，如果压力没有明显下降，则是过滤白头堵塞。

处理方法：将过滤白头取出，用10%的异丙醇超声半个小时。如果压力降至100 PSI（6.7 Bar）以下，过滤白头正常，再检查；

c. 把色谱柱出口端取下，如果压力不下降，则是柱子堵塞。

处理方法：如果是缓冲盐堵塞，则用95%的水冲至压力正常。如果是一些强保留的物质导致堵塞，则要用比现在流动相更强的流动相冲至压力正常。假如按上面的方法长时间冲洗压力都不下降，则可考虑将柱子的进出口反过来接在仪器上，用流动相冲洗柱子。这时，如果柱压仍不下降，只有换柱子入口筛板，但一旦操作不甚，很容易造成柱效下降，所以尽量少用。

（2）压力过低

a. 压力过低的现象一般是由于系统泄漏，处理方法：寻找各个接口处，特别是色谱柱两端的接口，把泄漏的地方旋紧即可；

b. 当然还有一个原因就是泵里进了空气，但此时表现的往往是压力不稳，忽高忽低，更严重一点会导致泵无法吸上液体。处理方法：打开Purge阀，用3~5 ml/min的流速冲洗，如果不行，则要用专用针筒在排空阀处借住外力将气泡吸出。

2、漂移问题

主要包括基线漂移和保留时间漂移。

（1）基线漂移

一般说来，仪器刚起动时，基线容易漂移，大概要半个小时的平衡时间。此外，在低波长下（220 nm）平衡时间相对会比较长。如果在实验过程中发现基线漂移，需要考虑以下原因：

a. 柱温波动。

解决方法：控制好柱子和流动相的温度，检查是否有打开的窗户或空调对着柱温箱；

b. 流通池被污染或有气体。

解决方法：用甲醇或其他强极性溶剂冲洗流通池（最好断开柱子）。如有需要，可以用1N的硝酸（不要用盐酸）；

c. 紫外灯能量不足。

解决方法：更换新的紫外灯；

d. 流动相污染、变质或由低品质溶剂配成。

解决方法：检查流动相的组成，使用高品质的化学试剂及HPLC级的溶剂；

e. 样品中有强保留的物质以馒头峰样被洗脱出，从而表现出一个逐步升高的基线。

解决方法：使用保护柱，同时，在分析过程中，定期用强溶剂冲洗柱子；

f. 检测器没有设定在最大吸收波长处。

解决方法：将波长调整至最大吸收波长处；

g. 流动相的PH值没有调节好。

解决方法：加适量的酸或碱调至最佳PH值。

（2）保留时间漂移

保留时间重现是液相性能好坏的一个重要标志。同一种物质，两次保留时间相差不要超过半分钟，超过了可看做保留时间漂移，则无法准确定性，此时需考虑以下原因：

a. 温控不当。解决方法：调好柱温，检查是否有打开的窗户或空调对着柱温箱；

b. 流动相比例变化。解决方法：检查四元泵的比例阀是否有故障；

c. 色谱柱没有平衡。解决方法：在每一次运行之前给予足够的时间平衡色谱柱；

d. 流速变化。解决方法：重新设定流速 ；

e. 泵中有气泡。解决方法：从泵中除去气泡 。

3、峰形异常问题

峰型问题是色谱分析的主要问题，在做液相过程中，一般是要变换不同的条件来改善不好的峰型。对于各种各样的异常峰，要区别对待，以下列出了几种常见峰形异常问题及解决方法。

a. 色谱图中未出峰。

解决方法：系统未进样或样品分解；泵未输液或流动相使用不正确；检测器设置不正确；针对以上情况成因作相应调整即可。

b. 一个峰或几个峰是负峰。

解决方法：流动相吸收本底高；进样过程中进入空气；样品组分的吸收低于流动相。

c. 所有峰均为负峰。

解决方法：信号电缆接反或检测器输出极性设置颠倒；光学装置尚未达到平衡。

d. 所有峰均为宽峰。

解决方法：系统未达到平衡；溶解样品的溶剂极性比流动相差很多；色谱柱尺寸及类型选择不正确；色谱柱或保护柱被污染或柱效降低；温度变化造成的影响。

e. 所出峰比预想的小。

解决方法：样品黏度过大；进样品故障或进样体积误差；检测器设置不正确；定量环体积不正确；检测池污染；检测器灯出现问题。

f. 出现双峰或肩峰。

解决方法：进样量过大；样品浓度过高；保护柱或色谱柱柱头堵塞；保护拄或色谱柱污染或失效；柱塌陷或形成短通道。

g. 前伸峰。

解决方法：进样量或样品浓度高；溶解样品的溶剂较流动相极性强；保护柱或色谱柱污染或失效。

h. 拖尾峰。

解决方法：柱超载，降低样品量；增加柱直径采用较高容量的固定相；峰干扰，对样品进行清洁过滤；调整流动相；硅羟基作用，加入三乙胺，用碱致钝化柱增加缓冲液或盐的浓度降低流动相pH值；柱内烧结不锈钢失效，更换烧结不锈钢；加在线过滤器，对样品进行过滤；死体积或柱外体积过大，将连接点降至最低；尽可能使用内径较细的连接管；柱效下降，更换柱子；采用保护柱，对柱子进行再生。

i. 出现平头峰。

解决方法：检测器设置不正确；进样体积太大或样品浓度太高。

j. 出现鬼峰。

解决方法：进样阀残余峰，在每次进完样后用充足的时间来平衡和清洗系统；样品中存在未知物，改进样品的预处理；流动相污染，更换新流动相，尽可能现配现用，隔夜的流动相再次使用时要过滤；尽可能使用HPLC级试剂；流路中有小的气泡，打开Purge阀，加大流速排除。

在排除故障时要遵循以下原则：（1）一次只改变一个因素，确定假定因素与问题之间的联系；（2）如果通过更换组件来排查故障时要注意将拆下的完好组件装回原位，避免浪费；（3）养成良好的记录习惯，这是成功进行故障排除的关键。

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“液相色谱仪”的维护小技巧

1、流动相溶剂瓶的保养

溶剂瓶是流动相的起点，通常是盛放水相溶液或是有机相溶液。

（1）对于水相溶液来说，首要的问题是防止污染。对于溶剂瓶，我们要做的非常重要的工作就是勤换流动相，常换常新。

（2）对于有机相溶液，可以不用担心细菌繁殖的问题。但是有机相容易发生聚合，特别是乙腈在适宜的光照条件下极易发生聚合，瓶子里就会出现一些絮状的聚合沉淀物。为了防止聚合过程的发生，装乙腈时要用棕色的溶剂瓶，避免阳光直射，更换乙腈时应当弃去瓶底剩余的溶液。

（3）清洗溶剂瓶里的过滤头，其作用是为了防止溶液瓶中的颗粒杂质进入到仪器的流路系统中，它的材质通常分为玻璃烧结石英和不锈钢，如果不慎堵塞会造成流动相吸液不畅，因此必须进行清洗，玻璃材质的通常是用稀硝酸泡，而不锈钢材质的可以直接进行超声清洗。

2、高压泵的保养

泵是液相色谱的重要组成部分，泵将流动相从溶剂瓶输送到液相流路系统中，并要在高压下保持流量和压力的稳定。

（1）泵压力波动，很多情况下，泵的问题反映在压力上，压力波动又是常见的一类问题。通常我们可以通过重新清洗流路和再次脱气流动相加以解决。

（2）过滤白头保养，在泵的维护里还有一项常做的工作就是更换清洗阀上的过滤白头，通常判断的标准是纯水以5mL/min流速清洗的时候，如果压力超过1MPa则考虑更换。

3、进样器的保养

进样器分手动和自动两大类，虽然两者工作模式不同，但使用的要点是基本一致的。

（1）防止交叉污染，自动进样器常见的问题是交叉污染，交叉污染产生的原因很直接，样品残留在进样针内外表面，并随下一次进样进入色谱系统。要解决交叉污染，主要靠清洗。自动进样器都会有洗针的功能，如果样品浓度较高或者是吸附性比较强，一定要打开此功能；如果未打开洗针功能，污染可能已经残留在了针座或流通阀上，那么这两个部件需及时超声清洗。

出现在自动进样器上的另外一个问题是峰面积重现性差，考虑可能与自动进样器吸取样品有关。首先观察样品的液面是不是足够高，以保证进样器可以吸到样品。排除这个问题后，再察看自动进样器的设置，对于一些粘度大的样品，要降低自动进样器的吸取速度。

（2）精细操作，手动进样器应使用液相色谱仪专用平头进样针，进样时插针应插到底，不使用时将针头留在进样器内，使用前后都要及时清洗。

4、色谱柱的保养

色谱柱是化合物分离的关键。保养良好的色谱柱具有很高的塔板数，且仪器基线平稳。

（1）色谱柱不能够碰撞、弯曲或强烈振荡。安装时要保证阀件或管路的清洁。

（2）应逐渐改变溶剂的组成，特别是反相色谱中，不应直接从有机溶剂改变为全部是水，反之亦然。

（3）分析结束后，要清洗进样阀中残留的样品，并用流动相或适当的溶剂清洗色谱柱。

（4）避免将基质复杂的样品尤其是生物样品直接注入柱内，需要对样品进行预处理或者在进样器和色谱柱之间连接一保护柱。保护柱一般是填有相似固定相的短柱。保护柱可以而且应该经常更换。

（5）经常用强溶剂冲洗色谱柱，清除保留在柱内的杂质。在进行清洗时，对流路系统中流动相的置换应以相混溶的溶剂逐渐过渡，每种流动相的体积应是柱体积的20倍左右，即常规分析需要50~75ml。

下面列举一些色谱柱的清洗溶剂及顺序，作为参考：

硅胶柱以正已烷（或庚烷）、二氯甲烷和甲醇依次冲洗，然后再以相反顺序依次冲洗，所有溶剂都必须严格脱水。甲醇能洗去残留的强极性杂质，已烷使硅胶表面重新活化。

反相柱以水、甲醇、乙腈、一氯甲烷（或氯仿）依次冲洗，再以相反顺序依次冲洗。

如果下一步分析用的流动相不含缓冲液，那么可以省略最后用水冲洗这一步。一氯甲烷能洗去残留的非极性杂质，在甲醇（乙腈）冲洗时重复注射100~200µl四氢呋喃数次有助于除去强疏水性杂质。四氢呋喃与乙腈或甲醇的混合溶液能除去类脂。有时也注射二甲亚砜数次。此外，用乙腈、丙酮和三氟醋酸（0.1%）梯度洗脱能除去蛋白质污染。

阳离子交换柱可用稀酸缓冲液冲洗，阴离子交换柱可用稀碱缓冲液冲洗，除去交换性能强的盐，然后用水、甲醇、二氯甲烷（除去吸附在固定相表面的有机物）、甲醇、水依次冲洗。

（6）保存色谱柱时应将柱内充满乙腈或甲醇，柱接头要拧紧，防止溶剂挥发干燥。禁止将缓冲溶液留在柱内静置过晚上或更长时间。

（7）色谱柱使用过程中，如果压力升高，一种可能是烧结滤片被堵塞，这时应更换滤片或将其取出进行清洗；另一种可能是大分子进入柱内，使柱头被污染；如果柱效降低或色谱峰变形，则可能柱头出现塌陷，死体积增大。

在后两种情况发生时，小心拧开柱接头，用洁净小钢将柱头填料取出1~2mm高度（注意把被污染填料取净）再把柱内填料整平。然后用适当溶剂湿润的固定相（与柱内相同）填满色谱柱，压平，再拧紧柱接头。这样处理后柱效能得到改善，但是很难恢复到新柱的水平。

柱子失效通常是柱端部分，在分析柱前装一根与分析柱相同固定相的短柱（5~30mm），可以起到保护、延长柱寿命的作用。

通常以硅胶为基质的色谱柱，只能在pH2~9范围内使用。柱子使用一段时间后，可能有一些吸附作用强的物质保留于柱顶，特别是一些有色物质更易看清被吸着在柱顶的填料上。新的色谱柱在使用一段时间后柱顶填料可能塌陷，使柱效下降，这时也可补加填料使柱效恢复。

5、检测器的保养

（1）光源部分

检测器中非常重要的部件是光源，光源对发射能量有要求，一旦能量衰减到一定程度，就会出现基线噪声变大，灵敏度降低等一系列影响使用的问题，因此光源是一个消耗品。通常紫外灯的寿命是2000h，当到达这个时限的时候，我们就要特别关注灯的能量状况，可以通过仪器维护软件中自带的“灯能量测试”功能来判断，测试的结果会分别评估低、中、高三个波长段的能量，一旦某个波长段的测试结果显示失败，就表示需要更换灯。

（2）检测池

检测器中另一个重要部件是检测池，也叫流通池。通常大家关心的一个问题是检测池被堵掉，因为检测池通常不是很耐压，所以一旦被堵就很可能造成损坏。事实上检测池通常不太容易被堵，原因是几乎所有的颗粒杂质都会被色谱柱拦下了，所以堵塞检测器的东西基本都不是来自样品的，很可能是后来“产生”的，比如含盐流动相残留在检测池中导致盐析出。

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“液相色谱仪”的操作流程及注意事项

使用前期准备工作：

1. 始终保持高效液相色谱仪器包括内在系统的清洁。

2. 室内温度始终保持恒定，因为室温的变化对高效液相色谱检测器有影响。

3. 所有溶液、试剂、样品、标准溶液、注射剂等都应事先准备好。

4. 最好提前准备好备用电源防止停电。

HPLC操作流程：

1．将已经过滤并脱气的流动相注入储液罐；

2. 用流动相冲洗金属过滤器，然后将过滤器浸入储液罐的流动相中；

3. 将储液罐放置在一定的高度，以避免由于搬运和其他操作人员的移动而造成不必要的跌落。

4. 然后按以下顺序依次启动高效液相色谱仪：泵→检测器→高效液相色谱软件→按预先计划的方法设置软件参数，如分析时间、检测波长、流速等。

5. 启动泵，运行5分钟，主要是为了排除系统中的气泡，结束后关闭所有排气阀；

6. 然后按照预先计划的速度，以固定的速率，如1mL/min左右，运行流动相，走基线，直到基线平稳，就可以在计算机软件上进行监视；

7. 基线平稳后，在软件中设置样品的运行参数，如流速和分析时间等。分析时间会因样品、流速、柱长等因素变化。

8. 参数设置完毕后，将固定体积的样品溶液注入进样阀，然后在软件中启动注入命令，进样器中的样品溶液就随流动相进入色谱柱；

9. 通过软件监视各项读数，当检测器检测到样品所有峰值，停止运行并设置新的进样。在下一个样品分析前，建议留出5-10分钟，待流动相通过色谱柱，以便清洗之前样品的残留物；确认基线稳定后，进行下一次注射。

10. 分析结束后，先关闭检测器，然后关闭泵，最后关闭软件。

HPLC分析注意事项：

1. 用0.2μm滤纸过滤溶剂或流动相，并进行超声脱气。

2. 启动时应采用色谱级水清洗色谱柱，有助于延长色谱柱的使用寿命、检测器的稳定运行，确保检测结果的准确性。

09

“液相色谱仪”的常见品牌

到了这里，相信各位已经对‍‍‍‍‍‍‍‍‍‍液相色谱仪有了很深的了解。如今，液相色谱仪的品牌都有哪些呢？最受关注的又是哪些呢？（以品牌简称首字母排序）

A. 安捷伦

产品：

Agilent 1290 Infinity II 液相色谱系统

Agilent 1260 Infinity II 液相色谱系统 等

▲ Agilent 1290 Infinity II 液相色谱系统

B. 岛津

产品：

岛津 Nexera LC-40 液相色谱仪

岛津新一代i-Series 液相色谱仪 等

▲ 岛津新一代i-Series 液相色谱仪

C. 华谱科仪

产品：

华谱科仪 S6000PLUS 超高效液相色谱仪 等

↑↑↑2022-2023年度品类先锋 优选仪器

▲ 华谱科仪 S6000PLUS 超高效液相色谱仪

D. 珀金埃尔默

产品：

LC 300 HPLC 等

▲ LC 300 HPLC

E. 日立Hitachi

产品：

日立Chromaster高效液相色谱仪

日立Primaide高效液相色谱仪 等

▲ 日立Chromaster高效液相色谱仪

F.赛默飞

产品：

Vanquish Neo UHPLC 系统

赛默飞Vanquish Core液相色谱 等

▲ Vanquish Neo UHPLC 系统

G. 上海科哲

产品：

上海科哲Anters-1200F2型高效液相色谱仪

上海科哲Anters-1200V型高效液相色谱仪 等

▲ 上海科哲Anters-1200F2型高效液相色谱仪

H. 天美（赛里安）

产品：

赛里安LC6000液相色谱仪 等

▲ 赛里安LC6000液相色谱仪

I. 通微

产品：

EasySep®-3030二元/四元液相色谱系统 等

▲ EasySep®-3030二元/四元液相色谱系统

J. Waters

产品：

Arc Premier系统

ACQUITY Premier系统 等

▲ Arc Premier系统

K. 皖仪

产品：

皖仪 LC3600系列超高效液相色谱仪 等

▲ 皖仪 LC3600系列超高效液相色谱仪

L. 伍丰仪器

产品：

伍丰液相色谱系统EX1800 等

↑↑↑2022-2023年度品类先锋 优选仪器

▲ 伍丰液相色谱系统EX1800

M. 悟空仪器

产品：

悟空仪器K2025 高效液相色谱仪 等

▲ 悟空仪器K2025 高效液相色谱仪

N. 依利特

产品：

EClassical 3200高效液相色谱仪 等

▲ EClassical 3200高效液相色谱仪

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