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RNA琼脂糖凝胶电泳实验知识介绍
2023-05-24 08:58:01
Mars
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来源:BIOFOUNT范德生物

琼脂糖凝胶。1.RNA琼脂糖凝胶电泳实验的实验目的

琼脂糖凝胶

通过该实验知识的分享和学习,使大家掌握植物总RNA非变性胶电泳的基本原理和实验方法。

2.RNA琼脂糖凝胶电泳实验原理

RNA电泳实验可以在变性以及非变性两种条件下进行。非变性电泳实验一般使用的1.0%--1.4%的凝胶,使不同的RNA条带也能分开,但通过该实验是无法判断其分子量。只有在RNA完全变性的条件下时,RNA的泳动率才会与分子量对数呈线性的关系。如果要测定RNA分子量时,必须要用变性凝胶。当然需要快速检测所提总RNA样品完整性时,配制普通1%琼脂糖凝胶即可满足实验要求。

3.RNA琼脂糖凝胶电泳实验所需的材料、器具、试剂

蘑菇的总RNA溶液。 电泳仪,电泳槽,电子天平,移液器,枪头,微波炉,紫外透射检测仪等。 琼脂糖,1XTAE电泳缓冲液,0.5μg/ml溴化乙锭(EB)10X载样缓冲液。

4.RNA琼脂糖凝胶电泳实验实验步骤

用1×TAE电泳缓冲液制作琼脂糖凝胶,加1×TAE电泳缓冲液至液面覆盖凝胶。

在超净工作台上,用移液器吸取总RNA样品4μl于封口膜上。在实验台上再加入5μl 1×TAE电泳缓冲液及1μl 的10X载样缓冲液,混匀后,小心加入点样孔。

打开电源开关,调节电压至100V,使RNA由负极向正极电泳,约30min后将凝胶放入EB染液中染色5min,用清水稍微漂洗。在紫外透射检测仪上观察RNA电泳结果。

5. 对RNA的变性琼脂糖凝胶进行检测:

实验所需试剂:

a.MOPS缓冲液(10x):0.4mol/L;吗啉代丙烷磺酸(MOPS) (Ph7.0);0.1mol/L NaAc;10mol/L EDTA;

b.上样需要的染料:50%甘油;1mol/L EDTA;0.4%溴酚蓝,0.4%二甲苯蓝;

c.甲醛;

d.去离子甲酰胺,电泳槽清洗过程:去污剂洗干净(一般长时间浸泡过夜)—水冲洗—乙醇干燥—3%H2O2灌满——室温放置10分钟—0.1%DEPC水冲洗。

6. 实验操作步骤:

(1) 将制胶用具用70%乙醇冲冼一遍,晾干备用。

(2) 配制琼脂糖凝胶。

①称取0.5g琼脂糖,置干净的100ml 锥形瓶中,加入40ml蒸馏水,微波炉内加热使琼脂糖彻底溶化均匀。

②待胶凉至60--70 ℃,依次向其中加入9ml 甲醛、5ml 10X MOPS缓冲液和0.5ul 溴化乙锭,混合均匀。

③灌制琼脂糖凝胶。

(3) 样品准备:

① 取 DEPC处理过的500ul小离心管,依次加入如下试剂: 10x MOPS缓冲液2ul,甲醛3.5ul,甲酰胺(去离子)10ul,RNA 样品 4.5ul,混匀。

② 将离心管置于60℃水浴中保10分钟,再置冰上2分钟。

③ 向管中加入3ul 上样染料,混匀。

(4)上样。

(5)电泳:电泳槽内加入1XMOPS缓冲液,于7.5V/ml 的电压下电泳。

(6)电泳结束后,在紫外灯下检查结果。

7. 案例:

Agarose gel electrophoresis showing total RNA extracted from P. orientalis leaves using five RNA isolation methods: CTAB method (lane 1), SDS method (lane 2), TRIzol method (lane 3), plant RNAout kit protocol (lane 4), and Improved plant RNAout kit protocol (lane5).

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